1.概述
 

　　液相色譜系統由泵及流路系統、進(jìn)樣系統、色譜柱系統以及檢測器系統構成，其中進(jìn)樣系統可細分為手動(dòng)進(jìn)樣與自動(dòng)進(jìn)樣，兩種進(jìn)樣方式均要求進(jìn)樣的準確性與精密度。其中手動(dòng)進(jìn)樣系統由于人為因素對進(jìn)樣的準確性有很多大的影響，如人員的手動(dòng)進(jìn)樣熟練程度等，漸漸退出市場(chǎng)。而自動(dòng)進(jìn)樣系統，由于具有很高的準確度以及精密度，幾乎排除人員因素的影響以及具有高通量、自動(dòng)運行序列等特點(diǎn)而成為HPLC系統的標配。
 

　　液相色譜進(jìn)樣系統位于泵后，色譜柱之前的高壓區域，如下圖所示。流動(dòng)相混合之后流經(jīng)進(jìn)樣系統，將樣品溶液帶入到色譜柱內，完成進(jìn)樣。
 

　　2.進(jìn)樣系統構成
 

　　進(jìn)樣系統一般由進(jìn)樣針、注射器或者計量泵、樣品托盤(pán)、定量環(huán)以及閥構成，其中閥是整個(gè)進(jìn)樣系統的核心，通過(guò)閥的切換做到在進(jìn)樣的過(guò)程中不停泵，保持流動(dòng)相持續不斷地流經(jīng)色譜柱。進(jìn)樣閥(六通閥)的典型結構如下圖2所示，主要由定子以及轉子構成，定子與定子面緊密接觸，其上的六個(gè)孔洞分別連接泵流路的方向，色譜柱，定量環(huán)，進(jìn)樣針或進(jìn)樣針座以及廢液接口。
 

　　在工作時(shí)，定子面(多為不銹鋼)，定子(多為陶瓷)以及轉子密封(多為聚合物)三者之間緊密接觸，由電動(dòng)馬達(手動(dòng)進(jìn)樣裝置有把手連接轉子)帶動(dòng)轉子轉動(dòng)實(shí)現進(jìn)樣狀態(tài)的改變。轉子密封的材質(zhì)一般為聚合物，不同材質(zhì)的轉子密封具有不同耐受環(huán)境限制，如聚酰亞胺材質(zhì)的轉子密封最大耐受的pH為10，若體系流動(dòng)相pH超過(guò)10的時(shí)候，就需要使用其他材質(zhì)如乙烯-四氟乙烯共聚物或聚醚醚酮聚合物材質(zhì)的轉子密封，不同材質(zhì)的轉子密封的耐受pH范圍。
 

　　轉子密封上面有弧狀的凹槽，其作用是通過(guò)轉子的轉動(dòng)將定子上的不同孔洞之間形成通路，一般有兩種形式。
 

　　轉子密封上有兩條凹槽，適用與手動(dòng)進(jìn)樣裝置，在進(jìn)樣時(shí)通過(guò)轉動(dòng)手柄或把手，實(shí)現進(jìn)樣閥在loading位與injection位的切換。圖B所示轉子密封上有三條凹槽，適用于自動(dòng)進(jìn)樣裝置。
 

　　3.手動(dòng)進(jìn)樣
 

　　手動(dòng)進(jìn)樣方式對于人員的熟練程度比較高，其基本流程如下。為loading位，此時(shí)流動(dòng)相直接通過(guò)定子與轉子與色譜柱相接，通過(guò)注射針將樣品注入定量環(huán)；為injection位，此時(shí)通過(guò)轉子轉動(dòng)，將泵、定量環(huán)、色譜柱形成一個(gè)通路，樣品溶液在流動(dòng)相的流動(dòng)下帶入到色譜柱。此時(shí)，與注射針相連接的定子上的孔徑與廢液相接，可注入溶劑或Blank進(jìn)行沖洗進(jìn)樣管路。
 

　　從其進(jìn)樣方式，還可以看出樣品進(jìn)入定量環(huán)的方向與樣品進(jìn)入色譜柱的方向是相反的。如果是滿(mǎn)環(huán)進(jìn)樣的話(huà)，前后的方向是否相反，其影響基本可以忽略；但在非滿(mǎn)環(huán)進(jìn)樣的情況下，前后方向相反，可以盡可能多的減少樣品在色譜柱外的柱外擴展作用。
 

　　此外，在進(jìn)樣完成之后，可不必急于將進(jìn)樣閥搬回loading位，依靠流動(dòng)相的流動(dòng)將定量環(huán)充分的沖洗之后，再搬回原位，為下一針做準備。
 

　　手動(dòng)進(jìn)樣有兩種方式，滿(mǎn)環(huán)進(jìn)樣與非滿(mǎn)環(huán)進(jìn)樣方式。在滿(mǎn)環(huán)進(jìn)樣的時(shí)候，注射器像定量環(huán)注入大于滿(mǎn)環(huán)體積的樣品溶液，多余的樣品溶液進(jìn)入廢液。非滿(mǎn)環(huán)進(jìn)樣方式，要求進(jìn)樣體積小于滿(mǎn)環(huán)體積的一半，兩種進(jìn)樣方式的區別。
 

　　此外，對于非滿(mǎn)環(huán)進(jìn)樣，之所以要求進(jìn)樣體積小于滿(mǎn)環(huán)體積的一半是因為，在非滿(mǎn)環(huán)條件下，定量環(huán)內存在兩種溶液，一是流動(dòng)相，二是樣品溶液。樣品溶液在注入到定量環(huán)中的時(shí)候與流動(dòng)相發(fā)生混合而被稀釋?zhuān)话愕兀?微升的樣品溶液會(huì )被稀釋為2微升。因此，非滿(mǎn)環(huán)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣體積最好小于滿(mǎn)環(huán)體積的一半。
 

　　4.自動(dòng)進(jìn)樣
 

　　自動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，連接轉子的手柄或把手被電動(dòng)馬達所代替，實(shí)現進(jìn)樣閥相位的改變。自動(dòng)進(jìn)樣一般有三種模式，分別為吸入式自動(dòng)進(jìn)樣，推入式自動(dòng)進(jìn)樣以及一體式自動(dòng)進(jìn)樣。不同的自動(dòng)進(jìn)樣方式具有不同的有點(diǎn)，同時(shí)也各自具有不同的缺點(diǎn)。
 

　　4.1吸入式自動(dòng)進(jìn)樣
 

　　吸入式自動(dòng)進(jìn)樣，亦即通過(guò)抽拉注射器將樣品溶液吸入到定量環(huán)中，首先是進(jìn)樣閥處于injection相位(圖7A)，流動(dòng)相從混合之后通過(guò)定量環(huán)進(jìn)入色譜柱。進(jìn)樣程序開(kāi)始時(shí)，進(jìn)樣閥相位調整到loading位(圖7B)，樣品在負壓的作用下進(jìn)入定量環(huán)，之后進(jìn)樣閥重新調整到injection相位，樣品溶液隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱。
 

　　當泵、定量環(huán)以及色譜柱之間形成通路的同時(shí)，針筒以及管路中的樣品被排入廢液，如圖8A所示；之后切換到loading位置，針筒抽吸洗針液對定量環(huán)進(jìn)行清洗，如圖8B所示。
 

　　吸入式自動(dòng)進(jìn)樣器，由于機械結構簡(jiǎn)單，因而易于維護以及便于排除故障，但較浪費樣品。
 

　　4.2推入式自動(dòng)進(jìn)樣
 

　　推入式自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣閥處于injection相位的時(shí)候，流動(dòng)相、定量環(huán)以及色譜柱構成一個(gè)完整的通路，此時(shí)進(jìn)樣針座與廢液聯(lián)通。樣品經(jīng)計量泵拉入臨時(shí)定量環(huán)中，如圖9A所示；之后進(jìn)樣閥切換到loading相位，進(jìn)樣針與針座連接，而針座與定量環(huán)連接，通過(guò)計量泵將樣品溶液推入到定量環(huán)中，如圖9B所示。
 

　　之后進(jìn)樣閥再次切換到injection相位，流動(dòng)相、定量環(huán)以及色譜柱構成一個(gè)完整的通路，樣品溶液隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱中。臨時(shí)定量環(huán)中的樣品溶液被排放入廢液，如圖10所示。
 

　　在injection相位下，計量泵泵入洗針液，之后進(jìn)樣閥切換到loading相位，進(jìn)樣針座與定量環(huán)聯(lián)通，對定量環(huán)以及進(jìn)樣針進(jìn)行清洗，并經(jīng)廢液排出，如圖11B所示。
 

　　推入式自動(dòng)進(jìn)樣器具有進(jìn)樣體積靈活可調節的特點(diǎn)，相比吸入式自動(dòng)進(jìn)樣器，樣品消耗較小；同時(shí)樣品經(jīng)進(jìn)樣針座進(jìn)入定量環(huán)的過(guò)程為低壓過(guò)程，便于控制以及對相關(guān)部位進(jìn)行密封。由于其機械結構相比吸入式自動(dòng)進(jìn)樣器復雜，發(fā)生故障時(shí)，不易于排除。
 

　　4.3一體式自動(dòng)進(jìn)樣
 

　　一體式自動(dòng)進(jìn)樣器的不同點(diǎn)在于進(jìn)樣針與定量環(huán)是一個(gè)整體。如同推入式自動(dòng)進(jìn)樣器一樣，首先進(jìn)樣閥處于injection相位，流動(dòng)相經(jīng)泵后與定量環(huán)及進(jìn)樣針、進(jìn)樣針座以及色譜柱形成通路，如圖12A所示。之后進(jìn)樣閥切換到loading相位，樣品溶液隨著(zhù)柱塞桿的拉出而進(jìn)入到定量環(huán)中，此時(shí)流動(dòng)相經(jīng)泵之后直接與色譜柱相連。
 

　　進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣閥重新切換回injection相位，樣品進(jìn)入色譜柱。之后，在下次進(jìn)樣之前一直處于該相位，以流動(dòng)相對定量環(huán)以及取樣針進(jìn)行沖洗。
 

　　該種進(jìn)樣方式具有很少浪費樣品，甚至不浪費樣品的特點(diǎn)，特別適合于樣品量比較少的情況；同時(shí)由于方法運行的絕大部分時(shí)間，進(jìn)樣閥均處于injection相位對定量環(huán)及進(jìn)樣針進(jìn)行沖洗，樣品殘留的可能性大大降低。由于進(jìn)樣針座處于HPLC系統的高壓處，對于連接處的密封性要求高，且該種方式的最大進(jìn)樣量也受到定量環(huán)大小的限制。
 

　　5.相關(guān)問(wèn)題
 

　　這里只涉及進(jìn)樣針樣品殘留以及系統污染兩種情形。
 

　　在相關(guān)色譜峰之間出現了一個(gè)峰寬異常(大于前后兩個(gè)色譜峰的峰寬)的色譜峰，這種情形一般是系統污染(色譜柱上的強保留成分)引起的；如圖14B所示在前后兩個(gè)色譜峰之間出現了峰寬與前后色譜峰峰寬差不多的色譜峰，這種情形一般是由于樣品污染(或者進(jìn)樣針或針座被污染)引起的。
 

　　此外值得注意的一點(diǎn)是，當進(jìn)樣閥的轉子密封墊上的凹槽隨著(zhù)使用時(shí)間的加長(cháng)以及磨損，進(jìn)而使得凹槽內部形成一定的死角，這種情況下易于發(fā)生樣品殘留現象；若不同的凹槽之間發(fā)生交聯(lián)時(shí)，會(huì )引起漏液；若凹槽由于磨損而變寬的話(huà)，會(huì )引起色譜峰變寬，色譜柱的表觀(guān)柱效降低。
 

　　6.結論
 

　　進(jìn)樣系統是HPLC的重要組成部分，其中手動(dòng)進(jìn)樣方式要求操作人員進(jìn)樣技術(shù)嫻熟，人為因素影響分析結果的可能性比較大；自動(dòng)進(jìn)樣器可以很好的解決進(jìn)樣重復性、準確性問(wèn)題，不受人為因素影響，同時(shí)還能夠實(shí)現通量操作。不同的自動(dòng)進(jìn)樣器具有不同的有點(diǎn)的同時(shí)也難免有一定的缺點(diǎn)，其中推入式以及一體式自動(dòng)進(jìn)樣器是應用較為廣泛的兩種自動(dòng)進(jìn)樣器。